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電鏡制樣樣本固定劑的分類和選擇
瀏覽次數:1896 發布日期:2017-03-20

電鏡制樣中使用的固定劑都有毒性,操作時都要很小心,盡可能在通風櫥中完成操作。如果實驗室中發生固定劑泄漏,必須立即用大量奶粉覆蓋泄漏出來的溶液,待反應充分后收集處理。

一、四氧化鋨(Osmium tetroxideOsmium tetroxide?

????? 四氧化鋨是一種很強的氧化劑氧化劑,呈淺黃色結晶,分子量254,飽和水溶液的,飽和水溶液的濃度為7.24%,它的水溶液為中性,有極大毒性。市售有密封的四氧化鋨晶體和四氧化鋨水溶液兩種。溶于水的速度很慢,必要時可以使用超聲波設備來加速溶解。市面上也有已經配制好的2%四氧化鋨水溶液出售,使用相當方便。但要特別注意的是無論是四氧化鋨晶體還是水溶液都會揮發出四氧化鋨氣體,因此應將四氧化鋨置于密閉容器(玻璃容器)中保存。四氧化鋨氣體對呼吸系統有刺激,對眼睛有嚴重的破壞作用,因此在使用時應特別小心,盡可能在通風櫥中進行,并且嚴格控制用量。廢棄的四氧化鋨溶液應加入酒精水溶液或硫酸亞鐵溶液,使四氧化鋨轉化為黑色沉淀,以降低溶液毒性,方便收集處理。? 四氧化鋨作為固定劑有如下優點:

????? 1.四氧化鋨可以與脂類、糖類糖類和蛋白質反應。其對脂類的固定作用可以補充醛類固定劑固定不足的缺點。?

???? 2.能增加膜的反差,起到" 電子染色電子染色"作用。用四氧化鋨固定的材料,往往細胞膜結構比較清晰。 這是由于被還原的鋨沉積在細胞膜細胞膜結構上,而鋨是一種原子序數較高的元素,能加強它們的電子散射(質量密度大),所以四氧化鋨四氧化鋨作為固定劑的同時,又可作為電子染料,使被固定的樣品圖像有較好的反差。?

???? 3.四氧化鋨會破壞大部分細胞膜的半透膜特性,配制四氧化鋨固定液不用考慮特性,配制四氧化鋨固定液不用考慮滲透壓。?

????? 四氧化鋨雖然具有以上優點,但它也存在不少缺點:

????? 固定劑四氧化鋨滲透力弱,所以組織塊要小。否則,將從組織塊表面到中間形成一個固定梯度,致使內部自溶過程繼續進行引起組織塊內部固定不好。不能保存糖原也不能有效固定核酸,而且對微管固定效果也不理想。

????? 固定的時間不宜太長。時間過長,會使組織變脆,給切片帶來困難。此外四氧化鋨與蛋白質、不飽和脂肪酸交聯形成的復合體都是易溶于水的物質,特別是在長時間的固定后,更易溶解。因此,使用四氧化鋨固定樣品,時間控制在12 小時較為適宜。?

????? 四氧化鋨能與乙醇或醛類起氧化-還原反應,生成沉淀。所以,醛類處理過的樣品轉入四氧化鋨固定之前或四氧化鋨固定之后轉入乙醇溶液脫水之前都必須用相應的緩沖液充分漂洗干凈。?

????? 四氧化鋨是酶的鈍化劑,不能用于細胞化學的研究。?

二、多聚甲醛(formaldehyde ?

????? 甲醛分子中只有一個碳原子碳原子,含有一個醛基,分子式為$CH_2O$,分子量分子量為30。市面上雖然有多種形式的甲醛溶液出售,但它們含有少量的甲酸和甲醇,對被固定的樣品產生不良影響,推薦電鏡制樣級別的多聚甲醛(paraformaldehydeElectron Microscopy Sciences海德生物總代,Cat.157-8))新鮮制備甲醛溶液。甲醛溶液的毒性很大,即使是稀釋液也要格外小心操作。甲醛溶液對皮膚有硬化作用,長時間接觸可能導致皮膚破裂、皮炎或是過敏癥狀;甲醛極易揮發,它對呼吸道也有影響,長時間暴露在甲醛氣體中會使嗅覺敏感度降低;此外甲醛對眼睛也有影響,而且還被認為是致癌物質致癌物質。因此在操作甲醛粉末或溶液時都必須很小心,帶上手套并在通風櫥中進行。少量廢棄的醛類試劑(甲醛、戊二醛和丙烯醛等)可以直接在大量流水沖稀的情況下倒進水池內(但要注意有關部門的有關規定),當然少量的醛類試劑與過量的1M 甘氨酸混合后,再在大量流水沖稀的情況下倒進水池,會更安全。通常100ml 的甲醛(1%) 需要50ml 1M 甘氨酸,100ml1%戊二醛則需要35ml,而丙烯醛需要40ml 。大量的醛類試劑必須集中回收處理。

????? 甲醛作為固定劑有如下特點:

???? ?由于甲醛的分子量小,它的穿透能力比戊二醛強,反應溫和,可用于細胞組織化學研究的前固定。而且它不象戊二醛有兩個醛基,引入較少的游離醛基到組織細胞中,因而在一些細胞組織化學研究中更有利。但它的反應是部分可逆的,對細胞是部分可逆的,對細胞基質保存差,脫水后大部分基質丟失,所以不少實驗室不單獨使用甲醛來固定樣品,而將它與戊二醛配制成混合固定液使用。

????? 甲醛對生物樣品的作用與戊二醛相似,主要引起蛋白質交聯。在水溶液中,單個的甲醛分子以HO ? CH2 ? OH 的形式存在。

????? 與戊二醛不同,甲醛既與DNADNA 又與核蛋白反應,但這些反應都是部分可逆的。另外,甲醛固定脂類的能力不強,可以與脂類相連的蛋白質作用。

三、戊二醛(glutaraldehyde

????? 戊二醛是一種五碳醛,含有兩個醛基。分子量為為100。電鏡固定通常用市售的????? 8%戊二醛,Electron Microscopy SciencesCat.16020)水溶液稀釋成需要的濃度。其pH 4.0-5.0 。氧氣、高溫、中性或堿性pH 均能使戊二醛發生聚合失去醛基,并降低交聯效力,所以平時這種原液應保存在低溫處。此外戊二醛存放時間過長時,pH 值會降低,顏色變黃,固定效力也大大降低,若戊二醛pH 值降至3.5以下或含有其它雜質時,必須純化后才能使用。戊二醛對皮膚有硬化作用,但它的揮發性較甲醛弱,最好能在通風櫥中操作。

????? 戊二醛作為固定劑有如下特點:

????? 它的反應速度快,是優良的前固定劑。但它的滲透速度較慢,必要時配合甲醛使用效果更佳。它是蛋白質的強固定劑。它能快速而不可逆地與氨基反應,脫水后生成不穩定的Schiff 鍵化合物。

????? 由于戊二醛有兩個醛基,它可以通過與相鄰的另一氨基反應,而產生交聯作用。醛基也可能與同一氨基作用,形成環狀結構。這種環狀結構可以進一步與另一戊二醛反應,生成丁間醇醛冷凝物 (Aldol condensate)(Aldol condensate)。這種化合物與氧分子共同作用,生成穩定的嘧啶類衍生物 (Pyridine derivatives),并在此過程中發生交聯。戊二醛的這一步與甲醛不同,戊二醛的這一步反應是不可逆的,而且需要氧氣的參與。由于大塊的樣品內部氧氣供應不足,戊二醛在大塊樣品的內部無法形成穩定的生成物,會導致樣品內部的固定效果不佳。因而在使用戊二醛固定時,小塊的樣品固定效果較為理想。戊二醛通過交聯作用固定蛋白質的過程會伴隨氫離子的釋放,使樣品pH值降低。為了維持pH 值穩定在最佳水平,在戊二醛的固定劑中要加入足量的緩沖液。

???? 戊二醛能通過固定核蛋白來固定組織和細胞中的DNA RNA,能保存糖原,也可以固定和蛋白質有關聯的或含有氨基和亞氨基亞氨基的脂類。但是只使用戊二醛固定的樣品無法阻止后面的脫水、滲透和包埋過程對樣品脂類的抽提,因而對細胞膜的固定效果不理想。?

???? 戊二醛在固定過程中并不完全破壞細胞膜的半透膜特性,因而需要選擇合適的固定液滲透壓,以免造成固定假象。但合適的固定液滲透壓隨被固定細胞和緩沖液的種類改變,很難找到一個通用的滲透壓。在實際操作中,1.0%--2.5\%戊二醛(使用0.1M 磷酸鹽緩沖液或液或0.1M 二甲胂酸鹽緩沖液)在一般情況下,已經能提供理想的固定效果。除非觀察到明顯的滲透壓造成的假象,一般不對固定液專門進行滲透壓調節。

???? 用戊二醛前固定的樣品不易變脆,可以進行長時間固定(但最好不要超過一個星期),因而適用于遠離實驗室或野外現場取材。但戊二醛在稀釋溶液中會自行發生一系列反應,因而固定液盡可能新鮮配制。?

四、其它固定劑?

???? 醋酸鈾(uranyl acetate既是一種固定劑又是一種染色劑。它可以與磷酸磷酸基團反應,從而固定DNA RNA,以及含有磷酸基團的的磷脂,從而對膜結構的保存有幫助。另外,它可以與蛋白中的酸性基團(如天冬氨酸殘基、谷氨酸殘基)和和堿性基團(如賴氨酸殘基)反應從而起固定蛋白的作用。但醋酸鈾不能很好保存糖原。通常在使用了醛類固定劑和四氧化鋨固定劑后,再使用0.5-1.0%的醋酸鈾水溶液進行第三重固定。操作醋酸鈾時要特別注意,盡管市售的醋酸鈾放射性不強,但它仍是一種潛在的致癌物,醋酸鈾應密封于棕色瓶陰涼處保存。

???? 丙烯醛(acrolein 是一種三碳醛,含有一個醛基和一個雙鍵。它比甲醛和戊二醛活潑,滲透組織的速度也比甲醛和戊二醛快。它可以很好地保存蛋白和和磷脂,最好作為甲醛或戊二醛固定液的添加劑使用。通常使用市售密封的100%丙烯醛液體,固定時使用的濃度小于1%。它溶于水的速度慢,毒性很大,著火點低,儲存和使用它都比上述另外兩種醛類危險,非必要時不推薦使用。丙烯醛非常活潑且揮發性很強,即使是操作稀釋后的溶液也要格外小心,所有與丙烯醛相關的操作絕不能離開通風櫥進行,并且最好有經驗豐富的操作者在場指導。丙烯醛適合于固定大塊的樣品,植物組織或有厚細胞壁的微生物樣品樣品,以及表面覆蓋有幾丁質或蠟質的樣品。但丙烯醛不適用于整個動物的灌注固定。?

???? 丹寧酸(Tannic acid 是一種從植物中提取的物質,泛指五倍子酸(gallic acidgallic acid )糖苷或多聚糖苷。大分子很難滲透到組織中,因此電鏡中使用低分子量的丹寧酸。丹寧酸既是一種強的固定劑,能固定許多蛋白以及糖類衍生物,又是一種媒染劑,能增強對重金屬 (如鈾、鉛)的吸收,從而增強樣品反差,特別是細胞外膜、、彈性纖維、細胞連接、肌肉纖維等。由于丹寧酸滲透速度慢,通常只用作滲透速度快的固定劑的添加劑使用。丹寧酸沒有固定的用法,0.5-2.0%丹寧酸和0.5mg/ml

皂角苷(saponin,增加丹寧酸的滲透速度)與2.5-4.0%戊二醛一起使用可以得到良好的效果。但固定時間要延長到3-4 小時以上,并且推薦使用醋酸鈾作第三重固定。丹寧酸適用于灌注固定。

???? 重鉻酸鉀(potassium dichromatepotassium dichromate在固定中有兩種作用,一是緩沖作用,二是固定作用,幫助保存脂類和糖類。在處理神經組織樣品時,因為重鉻酸鉀能很好地保存髓磷脂,可與四氧化鋨配合使用,作為第二重固定劑。但需要注意的是,重鉻酸鉀是一種致癌物質,應小心操作。

???? 高錳酸鉀(potassium permanganatepotassium permanganate)可以與脂類反應,增強膜結構的反差反差。可以保存DNA和糖原,但有一定的抽提作用,幾乎無法固定細胞內的顆粒性或纖維狀結構,可能會引入一些假象。穿透性強,適用于有厚細胞壁或蠟質層包被的植物,使用時可以不加緩沖液,固定時間不宜太長,,0.5-1.0%高錳酸鉀溶液固定30 分鐘到2 小時。

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